Usando a luz para manipular a excitabilidade dos neurônios

Polimerização optogenética e montagem de materiais eletricamente funcionais em células. (A) As proteínas fotossensibilizadoras (PS) são expressas no citosol dos tipos de neurônios geneticamente especificados. Após irradiação de luz (hν‌) e introdução de monômeros poliméricos, as proteínas fotossensibilizadoras geram localmente oxigênio singleto (¹O2) após cruzamento intersistema (ISC), que polimeriza e monta polímeros condutores ou isolantes na célula e na membrana celular, modulando a capacitância e excitabilidade da membrana (V_m, potencial de membrana). (B e C) Fluorescência confocal fundida (esquerda) e luz transmitida (TL; direita) imagens de rim embrionário humano fixo (HEK) células 293T coexpressando dTomato (vermelho) e miniSOG (verde) após 7 min de irradiação na presença de 1 mM DAB [labeled as poly(3,3′-diaminobenzidine) (PDAB⁺)] (B) e 1 mM de anilina e 1 mM de N-fenil-p-fenilenodiamina (PPD) [labeled as photopolymerized polyaniline (PANI⁺)] (C). As linhas tracejadas brancas representam o limite de irradiação formado pela fonte de luz de epifluorescência; A mancha nuclear Hoechst 33342 é mostrada em azul; todas as barras de escala são de 50 µm. (D) Deposições de PDAB e PANI foram quantificadas medindo o brilho de pixel das células nas imagens TL e normalizando-o para o fundo médio das partes livres de células da imagem. Os valores representam médias ± SEM; testes t bicaudais não pareados. ****P = menor que 0,0001. (E e F) Fluorescência confocal mesclada e imagens TL de neurônios corticais de ratos fixos expressando miniSOG (miniSOG⁺ neurônios) após 7 min de irradiação na presença de 1 mM DAB (E) e 1 mM de anilina e 1 mM de PPD (F). (G e H) Imagens correspondentes de neurônios expressando apenas mCherry (miniSOG⁻ neurônios). (I e J) Deposição de polímeros isolantes (I) e condutores (J) quantificados conforme descrito em (D). ns, não significativo. Crédito: Avanços da ciência (2022). DOI: 10.1126/sciadv.ade1136

Quase 20 anos atrás, os cientistas desenvolveram maneiras de estimular ou silenciar os neurônios, iluminando-os. Essa técnica, conhecida como optogenética, permite aos pesquisadores descobrir as funções de neurônios específicos e como eles se comunicam com outros neurônios para formar circuitos.

Com base nessa técnica, os pesquisadores do MIT e da Universidade de Harvard criaram uma maneira de alcançar mudanças de longo prazo em atividade neuronal. Com sua nova estratégia, eles podem usar exposição à luz para alterar a capacitância elétrica das membranas dos neurônios, o que altera sua excitabilidade (quão fortemente ou fracamente eles respondem a sinais elétricos e fisiológicos).

Alterações na excitabilidade dos neurônios têm sido associadas a muitos processos no cérebro, incluindo aprendizado e envelhecimento, e também foram observadas em alguns distúrbios cerebrais, incluindo a doença de Alzheimer.

“Esta nova ferramenta foi projetada para ajustar a excitabilidade dos neurônios para cima e para baixo de uma maneira controlada por luz e a longo prazo, o que permitirá aos cientistas estabelecer diretamente a causalidade entre a excitabilidade de vários tipos de neurônios e comportamentos animais”, disse Xiao Wang, o Thomas D. e Virginia Cabot Professor Assistente de Química no MIT e membro do Broad Institute do MIT e Harvard. “A aplicação futura de nossa abordagem em modelos de doenças dirá se o ajuste fino da excitabilidade dos neurônios pode ajudar a redefinir os circuitos cerebrais anormais ao normal”.

Wang e Jia Liu, professor assistente da Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas de Harvard, são os autores seniores do artigo, publicado hoje na Avanços da ciência.

Chanan Sessler, um estudante de pós-graduação do MIT no Departamento de Química; Yiming Zhou, pós-doutorando no Broad Institute; e Wenbo Wang, um estudante de pós-graduação em Harvard, são os principais autores do artigo.

Manipulação de membrana

A optogenética é uma ferramenta que os cientistas usam para manipular a atividade dos neurônios, projetando neurônios para expressar canais iônicos sensíveis à luz. Quando esses neurônios modificados são expostos à luz, as mudanças no fluxo de íons através dos canais suprimem ou aumentam a atividade dos neurônios.

“Ao usar a luz, você pode abrir ou fechar esses canais iônicos, o que, por sua vez, excitará ou silenciará os neurônios. Isso permite uma resposta rápida em tempo real, mas significa que, se você quiser controlar esses neurônios, terá que estar constantemente iluminando-os”, diz Sessler.

A equipe do MIT e de Harvard decidiu modificar a técnica para que pudessem gerar mudanças mais duradouras na excitabilidade, em vez de ativação transitória ou supressão da atividade. Para fazer isso, eles se concentraram em alterar a capacitância da membrana celular, que é um fator determinante da capacidade da membrana de conduzir eletricidade.

Quando a capacitância do membrana celular aumenta, os neurônios tornam-se menos excitáveis ​​- isto é, menos propensos a disparar um potencial de ação em resposta a estímulos de outras células. Quando a capacitância diminui, os neurônios se tornam mais excitáveis.

“A excitabilidade dos neurônios é governada por duas propriedades da membrana: condutividade e capacitância. Embora muitos estudos tenham se concentrado na condutividade da membrana executada por canais iônicos, os processos de mielinização que ocorrem naturalmente sugerem que a modulação da capacitância da membrana é outra maneira eficaz de ajustar a excitabilidade do neurônio durante o desenvolvimento do cérebro, aprendizado e envelhecimento. Então, nos perguntamos se poderíamos ajustar a excitabilidade do neurônio alterando a membrana capacitância“, diz Liu.

Enquanto era pós-doutorando na Universidade de Stanford, Liu e seus colegas mostraram que podiam alterar a excitabilidade dos neurônios induzindo-os a montar polímeros condutores ou isolantes em suas membranas. Nesse estudo, publicado em 2020, Liu usou uma enzima chamada peroxidase para montar os polímeros. No entanto, essa abordagem não permitia controle preciso sobre onde os polímeros se acumularam. Também representava algum risco porque a reação requer peróxido de hidrogênio, que pode danificar as células.

Para superar essas limitações, o laboratório de Liu em Harvard se uniu ao laboratório de Wang no MIT para tentar uma nova abordagem. Em vez de usar peroxidase, os pesquisadores fizeram uso de uma proteína sensível à luz geneticamente modificada que pode catalisar a formação de polímeros.

Trabalhando com neurônios cultivados em laboratório, os pesquisadores projetaram as células para expressar essa proteína sensível à luz, conhecida como miniSOG. Quando ativado por comprimentos de onda azuis de luz, o miniSOG produz moléculas altamente reativas chamadas espécies reativas de oxigênio. Ao mesmo tempo, os pesquisadores expõem as células a blocos de construção de um polímero condutor, conhecido como PANI, ou de um polímero isolante, conhecido como PDAB.

Após vários minutos de exposição à luz, as espécies reativas de oxigênio estimulam esses blocos de construção a se agruparem em PDAB ou PANI.

Usando uma técnica conhecida como patch clamp de células inteiras, os pesquisadores descobriram que os neurônios com polímeros PANI condutores tornaram-se menos excitáveis, enquanto os neurônios com polímeros PDAB isolantes tornaram-se mais excitáveis. Eles também descobriram que exposições mais longas à luz produziram mudanças maiores na excitabilidade.

“A vantagem da polimerização optogenética é o controle temporal preciso sobre a reação de polimerização, que permite o ajuste gradual previsível das propriedades da membrana”, diz Zhou.

Mudanças duradouras

Os pesquisadores mostraram que as mudanças na excitabilidade duraram até três dias, o máximo que conseguiram manter os neurônios vivos em sua placa de laboratório. Eles agora estão trabalhando na adaptação dessa técnica para que ela possa ser usada em fatias de tecido cerebral e, esperam, no cérebro de animais como camundongos ou o verme C. elegans.

Esses estudos com animais podem ajudar a esclarecer como as mudanças na excitabilidade dos neurônios afetam distúrbios como a esclerose múltipla e a doença de Alzheimer, dizem os pesquisadores.

“Se tivermos uma certa população de neurônios que sabemos ter maior ou menor excitabilidade em uma doença específica, então podemos potencialmente modular essa população transduzindo camundongos com uma dessas proteínas fotossensibilizantes que são expressas apenas naquele tipo de neurônio, e então ver se isso tem o efeito desejado no comportamento”, diz Wenbo Wang. “Em um futuro próximo, vamos usá-lo mais como um modelo para investigar essas doenças, mas você pode imaginar possíveis aplicações terapêuticas.”

Esta história foi republicada por cortesia do MIT News (web.mit.edu/newsoffice/), um site popular que cobre notícias sobre pesquisa, inovação e ensino do MIT.